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ELISA技術(shù)綜述(一)

點(diǎn)擊次數(shù):14276   發(fā)布時(shí)間:2023/5/8 15:15:50

 
ELISA原理
 
ELISA利用抗原抗體之間一性結(jié)合之特性,對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè);由于結(jié)合與固體承載物(一般為塑膠孔盤)上之抗原或抗體仍可具有免疫活性,因此設(shè)計(jì) 其結(jié)合 機(jī)制後,配合酵素顯色反應(yīng),即可顯示特定抗原或抗體是否存在,并可利用顯色之深淺進(jìn)行定量分析。根據(jù)待測(cè)樣品與結(jié)合機(jī)制的不同,ELISA可設(shè)計(jì)出各種不 同類型的檢測(cè)方式,主要以"三明治法"(sandwich)、"間接法"(indirect)、以及"競(jìng)爭(zhēng)法"(Competitive)三種為主,以下 為各種方法之介紹。
 
ELISA分類
 
見ELISA的雙抗夾心法原理;
 
ELISA的雙抗夾心法,又稱"三明治法"。
 
三明治法常用于檢測(cè)大分子抗原,一般之操作步驟為:
 
將具有一性之抗體固著(coating)于塑料孔盤上,完成後洗去多馀抗體;
加入待測(cè)標(biāo)本,標(biāo)本中若含有待測(cè)之抗原,則其會(huì)與塑料孔盤上的抗體進(jìn)行一性結(jié)合;
洗去多馀待測(cè)標(biāo)本,加入標(biāo)記有酵素之二次抗體,與抗原結(jié)合;
洗去多馀未結(jié)合的二次抗體,加入酵素受體使呈色,以肉眼或儀器讀取顯色結(jié)果。
 
三明治法分別以兩種抗體對(duì)標(biāo)本中的抗原進(jìn)行兩次一性辨認(rèn),因此一性相當(dāng)高,但此待測(cè)抗原必須是多價(jià)抗原,如此才可獲得兩種以上的一性抗體,以分別進(jìn)行夾心;而且此法需要足夠的表位空間以進(jìn)行抗原抗體的夾心,所以并不適用于半抗原或小分子抗原等分子量較小之標(biāo)的。
 
ELISA雙抗夾心法的衍生方法如ABC法:ELISA的生物素 -親和素系統(tǒng),該產(chǎn)品系列是檢測(cè)方法上的重要革命。生物素/親和素系統(tǒng)用于ELISA一般有三種形式,即橋聯(lián)法(BAB)、標(biāo)記法 (BA)和ABC法,不少學(xué)者用之檢測(cè)了不同的抗原—抗體系統(tǒng)均取得了較好的結(jié)果,其中以BA法和ABC法應(yīng)用較多,敏感性一般比常規(guī)ELISA法高 4~80倍。
 
所謂ABC技術(shù)是指Avidin : Biotinylated Enzyme Complex Technology,親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物技術(shù),所謂的ABC系統(tǒng),被普遍視為目靈敏、可靠與有效的染色系統(tǒng),并被廣泛應(yīng)用于免疫 組織化學(xué)、免疫電鏡、原位雜交與凝集素化學(xué)中。而該系統(tǒng)仍在不斷地發(fā)展,以滿足廣大研究人員的各種不同要求(如多抗原的標(biāo)記檢測(cè))。
 
ELISA的間接法:
 
間接法常用于檢測(cè)抗體,一般之操作步驟為:
將已知之抗原固著于塑膠孔盤上,完成後洗去多馀之抗原;
加入待測(cè)標(biāo)本,標(biāo)本中若含有待測(cè)次抗體,則其會(huì)與塑膠孔盤上的抗原進(jìn)行一性結(jié)合;
洗去多馀待測(cè)標(biāo)本,加入帶有酵素之二次抗體,與待測(cè)次抗體結(jié)合;
洗去多馀未結(jié)合的二次抗體,加入酵素受體使酵素顯色,以肉眼或儀器讀取顯色結(jié)果。
 
ELISA的競(jìng)爭(zhēng)法原理;
 
競(jìng)爭(zhēng)法是一種較少用到的ELISA檢測(cè)機(jī)制,一般用于檢測(cè)小分子抗原,其操作步驟為:
將具有一性之抗體固著于塑膠孔盤上,完成後洗去多馀抗體;
加入待測(cè)標(biāo)本,使標(biāo)本中的待測(cè)抗原與塑膠孔盤上的抗體進(jìn)行一性結(jié)合;
加入帶有酵素之抗原,此抗原也可與塑膠孔盤上的抗體進(jìn)行一性結(jié)合,由于塑膠孔盤上固著的抗體數(shù)量有限,因此當(dāng)標(biāo)本中抗原的量越多,則帶有酵素之抗原可結(jié)合的固著抗體就越少,亦即,兩種抗原皆競(jìng)相與塑膠孔盤上抗體結(jié)合,即所謂競(jìng)爭(zhēng)法之由來(lái)。
洗去標(biāo)本與帶有酵素之抗原,加入酵素受體使酵素顯色,當(dāng)標(biāo)本中抗原量越多,代表塑膠孔盤內(nèi)留下的帶有酵素的抗原越少,顏色也就越淺。
當(dāng)需要檢測(cè)無(wú)法獲得兩種以上單一性抗體的抗原,或是不易得到足夠的純化抗體以固著在塑膠孔盤上時(shí),一般會(huì)考慮使用競(jìng)爭(zhēng)法ELISA。

原創(chuàng)作者:上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)發(fā)展有限公司

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