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技術(shù)文章

ELISA技術(shù)綜述(五)

點擊次數(shù):14268   發(fā)布時間:2023/6/5 16:01:26

 
其他內(nèi)容:
 
酶聯(lián)免疫測定技術(shù)的多酶聯(lián)放大系統(tǒng):
 
一、AP底物放大系統(tǒng)
 
substrate ampiification system
AP可催化底物NADP+脫磷酸而生成NAD+(輔酶1),以乙醇作還原劑,在醇脫氧酶催比下,乙醇脫氫,NAD+還原為NADH,NADH在黃遞酶的催 化下脫氫,同時四唑鹽(tetrazoliim)被還原成有色的甲蠟(formazan)。AP不斷催化NAD+生成,NAD+與NADH循環(huán)轉(zhuǎn)化,不斷 生成甲蠟。整個反應周期由AP及醇脫氫酶、黃遞酶組成酶聯(lián),每個AP分子每分鐘可催化生成6X104個NAD+分子,而每個NAD+每分鐘又可使60個 甲臘分子產(chǎn)生。這種由Selfl984年次報道的EIA放大系統(tǒng)可使EIA的測定敏感性提高約250倍。
 
但Brooks等發(fā)現(xiàn)上述底物反應循環(huán)中產(chǎn)生的乙醛對整個酶聯(lián)反應有抑制作用,影響放大效果,而當加入鹽酸氨基脲時,則可進一步延長反應循環(huán),從而增加 測定敏感性,這是因為鹽駿氨基脲可與乙醛反應生成縮氨基脲(semicarbatone)和水,這樣就消除了乙醛對反應的抑制阼用。應用這種改進方法測定 食物中含蛋白A的金黃色葡萄球菌,測定敏感性從Self原方法的(4~6)X103菌落形成單位(c.{.u)/g或m1,到20個菌落形成單位 (c.f.u)/g或ml,測定敏惑性約提高200—300倍。
 
后來Self等又用刃天青(resazurin)代替其原來放大模式中的四唑鹽,刃天青在黃遞酶的作用下成為發(fā)出熒光的resorufin,然后使用熒光比色計測定得到結(jié)果。這種方式的測定敏感性也較原始方法大為提高,每孔內(nèi)僅含約350個AP分子也可測出。
 
二、雙酶聯(lián)放大系統(tǒng)
 
dual-enzyme cascade雙酶聯(lián)放大系統(tǒng)又稱酶抑制聯(lián)放大系統(tǒng),酯酶抑制劑4—(3—氧—4,4,4—三氟丁基)苯磷駿鹽因其帶有封閉性—P04基團,對酯酶不具抑制活性,但 當其在AP作用下脫—PO4基時,失活的抑制劑即成為具活性的抑制劑,使加入的羧酸酯酶失活,通過顯色反應測定殘留的酯酶活性即可知原始AP的活性,二者 成反比相關(guān)。這種放大系統(tǒng)的測定敏感性較普通方法可提高約125倍。
 
三、酶激活聯(lián)放大系統(tǒng)
 
enzymeactivationcascade這亦是一種以AP為標記酶的放大系統(tǒng)。黃素—腺嘌呤二核苷酸磷酸(FADP)在AP的催化下脫磷酸為FAD,F(xiàn)AD則使脫輔基的氨基酸氧化酶轉(zhuǎn)化為全酶的 氨基酸氧化酶,后者催化晡氨酸生成H2O2,于是在DCHBS,4AAP及HRP存在下,得到有色產(chǎn)物。上述放大系統(tǒng)可測定l{mol/LAP。
 
此外,催化指示物沉著(catalyzedreporterdeposition,CARD)也是一種多酶聯(lián)EIA放大系統(tǒng)。HRP氧化生物素或熒光素 標記的酪胺所產(chǎn)生的游離基,可與固相上蛋白的酪氨酸、色氨酸反應而使大量的生物素或熒光素沉著于固相上HRP周圍的區(qū)域內(nèi),沉著的生物素可用HRP及6— 半乳糖苷酶或AP標記的鏈霉親合素測定,沉著的熒光素則可用酶標抗熒光素測定。這樣使得一分子HRP轉(zhuǎn)化為大量的標記物,從而大為改善(約30倍)EIA 的測定敏感性。Diamandis等使用螯合的Eu3+鏈霉親合素—甲狀腺球蛋白試劑替代上述酶標物測定AFP,不但提高了測定敏感性,而且也使背景“噪 聲”較普通方法改善了6~8倍。我們將上述CARD放大系統(tǒng)直接用于HBsAg商品ELISA試劑盒,在不改變商品試劑盒任何成分和操作步驟的情況下,可 將試劑盒的測定敏感性提高約5倍。
 
四、凝固因子酶聯(lián)放大系統(tǒng)
 
脂多糖(1ipopolysaccharide,LPS)可激活鱟血細胞裂解物的凝固聯(lián)反應。先LPS使因子C激活為C,后者又激活因子B為B,B使 凝固酶轉(zhuǎn)化為凝固酶,凝固酶則催化底物(Boc-Le,u-Gly-Arg-p)產(chǎn)生有色的對硝基苯胺(曠 nitroa·niline,PNA),A405nm測定。因此,在免疫測定中,如以LPS作為標記物標記抗體,則可通過上述反應使測定敏感性放大,可檢 出10-7~10-11g/m1的IgG和10-7~10-11g/ml的抗IgG,Seki等將上述方法用于雙夾心法檢測HBsAg,敏感性達 10-10~10-12g/ml。
 
五、免疫復合物轉(zhuǎn)移兩位點酶免疫試驗
 
一般來說,在酶免疫測定中,限制測定敏感性的一個重要因素是非特異地結(jié)合于固相的標記酶的顯色反應,因其會使背景顯色加深,從而掩蓋了低濃度待測物所致的 特異顯色,解決這個問題提高測定敏感性的一條途徑是將待測物——抗體—酶復合物從固相上洗提至另一個固相,使用一雙標抗體[如生物素和二硝基苯(DNP) 標記的抗體]和一酶標抗體即可達到這個目的,在液相中形成的免疫復合物(雙標抗體:抗原:抗體:酶)捕獲于DNPIgG包被的聚苯烯珠上,洗滌后,使用二 硝基苯—L—賴氨酸將其從固相上取代下來,然后再將上述免疫復合物捕獲于鏈霉親合素包被的聚苯烯珠上,后進行酶反應顯色測定。Hashida和 shikawa使用該方法測鐵蛋白敏感性達到1zeptomole(1X10-21mol,約600個分子),較常規(guī)方法提高了30倍。眾多的研究者用該 方法測定抗甲狀腺球蛋白IgC及抗HTLV—1 IgG和抗HIV-1 IgG,敏感性均遠遠地超過常規(guī)方法,取得了良好的效果。
 
此外,Domingo和Marco等在進行點免疫結(jié)合試驗時,以4—氯—1—萘酚作為HRP的底物,反應后得到的不可溶產(chǎn)物因其具有特殊的紫外吸收及熒光 幻滅特征而可在紫外燈下觀察結(jié)果。由于沉著于膜上的物質(zhì)是HRP反應的中間產(chǎn)物,而非可見光下能見到的終產(chǎn)物,所以可大幅度地提高這種固相免疫測定的敏 感性,較常規(guī)方法約增加100倍。至于酶脂質(zhì)體放大系統(tǒng)(1iposomeamplificationsystem),也是一種新型高效的EIA測定放大 系統(tǒng)。
 
綜上所述,EIA測定放大方式雖然多種多樣,且不斷推陳出新,但研究者的出發(fā)點無非是一方面力降低影響測定敏感性的非特異顯色,如通過 增加操作步驟而達到上述目的的免疫復合物轉(zhuǎn)移兩位點酶免疫試驗;另一方面則是通過質(zhì)量提高的信號,從而達到提高敏感性的目的,如增加反應層次的生物素—親 合素,多酶聯(lián)等放大系統(tǒng)。但嚴格地講,真正稱得上是EIA測定放大系統(tǒng)的僅限于后者,者還只能說是一種所謂的超敏感 EIA(uhrasensitive enzyme immunoassay)。至于利用酶反應產(chǎn)物特征改變檢測手段(如發(fā)光或熒光檢測)而使EIA測定敏感性提高,則只不過是依靠儀器開闊了“視野“而已。

原創(chuàng)作者:上海恒遠生物技術(shù)發(fā)展有限公司

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